引物设计原则是:
1、引物长度一般为15-30bp,常用的为18-27bp,但不能大于38bp。
2、引物GC含量一般为40%-60%,以45-55%为宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之间,Tm值曲线以选取72度附近为佳,5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合。
4、ΔG值(自由能)反应了引物与模板结合的强弱程度,3'端的ΔG值相对要低,且绝对值不要超过9,否则不利于正确引发反应,3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时,PCR产量几乎达到百分之百,但在-6时只达到40%,-8时少于20%,-10时接近于0。
5、错配率一般不要超过100,否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列,还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大,比如在正确位点的引发效率为340以上,而在错误位点的引发效率为110,并且不好找到其他更合适的引物,那么这对引物是可以接受的。
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标,解释了序列片段存在的重复几率大小,选取引物时,应该用Frq值相对较低的片段。
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5,否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生。
8、3'端最好不要是连续碱基,GGG或CCC会导致错误的引发,同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T,若是,会导致错配。
9、以公式Tm=4*(G+C)+2*(A+T)-5计算Tm值,也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度,最好保证每个引物的Tm值相匹配,且在70-75℃范围内。
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小,PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度,如果期待的产物长度等于或小于500bp,选用端的引物(16-18bp),如果产物长5kb,则用24bp的引物。
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定(GC含量多),而3'端不稳定(AT含量多)的引物,这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大,20摄氏度范围内最好。
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